組件高效液相色譜柱這也稱為固定相。這是高效液相色譜機器的核心，由多種物質通常二氧化硅中的一種制成，二氧化硅和過量碳反應，碳鏈是非極性的，因此碳鏈越長，色譜柱的非極性越大。含有 18 個碳鏈的色譜柱是常用的，稱為 C18 色譜柱。高效液相色譜樣品樣品類型因領域和相關化合物的類型而有很大差異。高效液相色譜可用于分析生物樣本（尿液、血液、唾液和肌肉）、環境樣本、藥物化學（藥物）和微生物學（真菌和細菌產生的毒素）中的化合物。進樣將樣品注入高效液相色譜柱。這曾經是手動執行的，經過升級改造后大多數儀器都能實現自動進樣，這樣更高效便捷，減少了手動輸入并允許更高的檢測量。

 

高壓泵將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑泵人裝有填充劑的色譜柱(固定相)中，樣品溶液經進樣器進入流動相，樣品中的各組分在固定相和流動相中具有不同的分配系數，在兩相中做相對運動時，經過反復多次的吸附-分解-吸附的分配過程，進行分離后依次進入檢測器，由記錄儀、積分儀或數據處理系統記錄色譜信號或進行數據處理而得到分析結果。

 

流動相這實際上只是水和有機溶劑的混合物。流動相之所以得名，是因為它移動通過色譜柱，同時從色譜柱中洗脫化合物，化合物通常沿濃度梯度洗脫，非極性溶劑的百分比同時增加，流動相逐漸變得更加非極性。高效液相色譜運行高效液相色譜可以以多種模式進行。常用的方法稱為反相，在這種模式下，化合物從極性*強的化合物開始，到非極性化合物結束。對于正相模式，高功率泵將樣品和流動相移動通過色譜柱，運行可能需要 10-60 分鐘。高效液相色譜圖 高效液相色譜圖顯示了化合物從化學反應中的分離，色譜圖是在 254 nm 處查看的。兩個主峰出現在 8.20 和 9 分鐘，代表具有這些保留時間的兩種化合物。吸光度單位 (AU) 的數量顯示在 Y 軸上，而運行時間顯示在 X 軸上。應用在生物學和醫學領域，高效液相色譜通常用作分析生物和環境樣品是否存在已知化合物（例如代謝物、藥物、毒素、殺蟲劑）的分析工具，并可幫助識別未知化合物。然而，在化學領域，高效液相色譜通常用于監測化學反應以及確定產品的純度。